DOSAGE CHEZ LE PORC

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6-E-0011-PORC

Porcine anti-thrombin receptor, ATR ELISA Kit

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6-E-0028-PORC

Porcine D-Dimer, D2D ELISA Kit

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Porcine fibrinogen fegradation product, FDP ELISA Kit

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Porcine fibrinogen, Fbg ELISA Kit

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Porcine low molecular weight heparin, LMWH ELISA Kit

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6-E-0119-PORC

Porcine plasminogen activator inhibitor 1, PAI-1 ELISA Kit

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6-E-0120-PORC

Porcine plasminogen activator inhibitor, PAI ELISA Kit

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Porcine platelet activating factor, PAF ELISA Kit

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Porcine platelet-derived growth factor, PDGF ELISA Kit

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Porcine tissue factor, TF ELISA Kit

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Porcine tissue-type Plasminogen Actilyse, t-PA ELISA Kit

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6-E-0154-PORC

Porcine von Willebrand Factor, vWF ELISA Kit

96 tests

Description


Les recommandations ci-dessous donnent des directives générales pour la mise au point d’une méthode ELISA mais ne se veulent pas absolues. L’optimisation des conditions de dosage reste sous la responsabilité des chercheurs.
Tampons de base :
  • Tampon TBS : 8,76 gr de NaCl + 2,42 gr de Tris base dans 900 mL d’eau déminéralisée. Ajuster le pH à 7,4 avec du HCl 6N puis ajuster le volume à 1 litre avec de l’eau déminéralisée.

  • Tampon pour le coating : 1,7 gr de Na₂CO₃ (carbonate de sodium 50 mM, pH 9,6) + 2,86 grammes de NaHCO₃ dans 900 mL d’eau déminéralisée. Ajuster le pH à 9,6 puis ajuster le volume final à 1 litre avec de l’eau déminéralisée.

  • Tampon de fixation : TBS contenant 2,0 % (p / v) de BSA.

  • Tampon de lavage : TBS contenant 0,05 % (v / v) de Tween 20.

  • Tampon de réaction : TBS contenant 0,02 % (p / v) de BSA et 0,05 % (v / v) de Tween 20.

Microplaque pour le coating : Sélectionnez des plaques qui ont été certifiées pour les applications ELISA. Diluer la protéine qui sera immobilisée au fond des puits (généralement un anticorps, cependant, certains dosages peuvent nécessiter que l’antigène soit immobilisé sur la plaque) à la concentration désirée dans le Tampon pour le coating. Pour les anticorps monoclonaux et pour les anticorps polyclonaux purifiés par affinité, nous recommandons une concentration du tampon de coating de 10 microgrammes par mL. Pour les anticorps polyclonaux non purifiés par affinité, nous recommandons une concentration du tampon de coating de 25 microgrammes par mL.
Ajouter la solution de coating sur la plaque d’essai (0,1 mL par puits est la pratique courante), couvrir la plaque et la laisser incuber pendant 2 heures à température ambiante, ou pendant la nuit (environ 16 heures) à 4° C.
Fixation : Retirer la solution de coating de la plaque et remplir les puits à 90 % de leur capacité (environ 400 microlitres pour une plaque standard de 96 puits) avec le tampon de fixation. Incuber la plaque pendant 2 heures à température ambiante, ou pendant une nuit (environ 16 heures) à 4° C.
Étalonnage : Les courbes d’étalonnage sont généralement générées par dilution de l’étalon titré à 100 ng par mL dans le Tampon de réaction avec des dilutions en série pour faire huit concentrations de l’étalon dans la gamme de 100 à 0,78 ng par mL. Ajouter 0,1 mL de chaque dilution dans les puits appropriés de la plaque. Les dosages des étalons sont généralement effectués en double.
Échantillons : Les échantillons sont dilués dans le Tampon de réaction de sorte qu’ils se trouvent dans la plage de travail de la courbe d’étalonnage (0,78 à 100 ng par mL). Ajouter 0,1 mL de chaque échantillon dans les puits appropriés de la plaque. Les échantillons sont généralement mesurés en double exemplaire à deux ou plusieurs dilutions.
Durées d’incubation : L’incubation primaire (celle impliquant les étalons ou les échantillons sur la plaque) est généralement réalisée en 2 heures à température ambiante ou pendant une nuit (16 heures) à 4° C.
L’incubation secondaire celles impliquant l’ajout des d’anticorps secondaires ou des conjugués d’anticorps est généralement effectuée pendant 1 heure à température ambiante.
Les temps d’incubation peuvent être raccourcis en effectuant les étapes à 37° C.
Une dilution de 5 microgrammes par mL pour les anticorps monoclonaux et 10 microgrammes par mL pour les anticorps polyclonaux est recommandée comme point de départ. D’autres phases d’optimisation peuvent être nécessaires en fonction de votre test.
Développement : Les deux enzymes les plus communes utilisées pour la détection sont la peroxydase de raifort et la phosphatase alcaline. Pour la peroxydase de raifort, les substrats les plus courants sont le tétraméthylbenzidine (TMB) et le o-phénylènediamine (OPD). Le substrat commun pour la phosphatase alcaline est le phosphate de p-nitrophényle (PNPP). Nous vous recommandons de suivre les instructions du fabricant pour l’utilisation de ces substrats.
Optimisation : Développer une méthode ELISA sensible et reproductible nécessite l’optimisation de nombreuses conditions, y compris le choix des anticorps, des concentrations d’anticorps, des temps d’incubation, des températures d’incubation, des conditions de lavage, etc. Le choix des anticorps et la concentration d’anticorps utilisés peut influer sur la sensibilité et le bruit de fond. Enfin, des ajustements de tampons peuvent être nécessaires pour obtenir des résultats optimaux.

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